Il procedimento


Ora che abbiamo appreso che cosa s'intende per coltura in vitro ed abbiamo a nostra disposizione tutto il materiale necessario, vediamo in dettaglio il procedimento pratico, tenendo presente ovviamente che sarà quasi impossibile ottenere gli stessi risultati che si ottengono in laboratorio.
Procedendo per passi, possiamo suddividere questa tecnica in più fasi e precisamente:

•   Preparazione dei vasetti
•   Preparazione del terreno di coltura (medium)
•   Sterilizzazione dei vasetti e del terreno di coltura
•   Sterilizzazione dei semi/talee
•   Inserimento semi/talee nei vasetti
•   Controllo delle colture

Preparazione dei vasetti


I vasetti costituiranno l'ambiente asettico dove si svilupperanno e cresceranno le nostre piante.
Dopo aver inserito il medium ed averlo sterilizzato, non dovrà essere più aperto se non per inserire i semi o le talee da coltivare.
Questa operazione dovrà essere svolta in un ambiente perfettamente sterile come ad esempio una cappa sterile o una growbox.
Nel caso si voglia invece sperimentare la crescita in vitro con semi piccolissimi come ad esempio quelli della drosera o dionaea, si potrà evitare l'utilizzo della growbox o cappa sterile, inserendo direttamente nel barattoli (dopo la sterilizzazione) i minuscoli semi mediante una siringa.
In questo caso il barattolo deve essere preventivamente modificato prima della sterilizzazione.
Con chiodo od un semplice cacciavite, pratichiamo un foro nel centro del tappo, basta un piccolo forellino di qualche millimetro, quel tanto che basta per infilarci un grosso ago di siringa.


Prendiamo un dischetto di cotone compresso, (tipo quelli usati per togliere il trucco) e posizioniamolo all'interno del coperchio in modo da coprire il foro e impedire l'entrate si spore presenti nell'aria.
Fissiamo l'ovatta con della pellicola alimentare(trasparente) che servirà a ridurre l'assorbimento di condensa da parte dell'ovatta evitando così il proliferarsi di agenti patogeni.
Attenzione: utilizzare silicone o colla che resista ad alte temperature.


Il nostro vasetto è così pronto per essere riempito con il terreno di coltura ed essere sterilizzato.

Preparazione del terreno di coltura (medium)

Questa fase è molto importante, poichè dalla scelta dei concimi, zuccheri e vitamine, dipenderà in buona parte la riuscita della coltivazione.


Dopo aver scelto gli elementi base per preparare il terreno di coltura, (ribadisco il concetto che non esiste una composizione specifica, ogni coltivatore potrà sperimentare diverse varianti di medium), vediamone la sua preparazione.
Mescoliamo il tutto scaldando il composto ottenuto a bagnomaria.
Quando il liquido tende a solidificarsi, togliamo dal fuoco e versiamo il contenuto nel vasetto per circa metà del suo volume.
Il vasetto ed il relativo terreno di coltura sono così pronti per essere sterilizzati.

Sterilizzazione dei vasetti e del terreno di coltura

Per la sterilizzazione del vasetto e del suo contenuto (medium), si può procedere con diverse tecniche tra le quali:
Forno elettrico: avvitare il tappo sul vasetto senza chiuderlo ermeticamente, ed introdurlo nel forno precedentemente riscaldato a 250° per circa 30 minuti.
Pentola a pressione: avvitare il tappo sul vasetto senza chiuderlo ermeticamente, ed avvolgere il tutto con della carta di alluminio, per evitare che i vapori acquei che si sviluppano all'interno della pentola, entrino nel vasetto.
Inserire il vasetto nella pentola (riempita con 2 - 3 cm. di acqua) e dal momento in cui questa entra in pressione, lasciar trascorrere almeno 15-20 minuti.
Molto importante: una volta estratto dal forno o dalla pentola a pressione, il vasetto non deve essere più assolutamente aperto se non all'interno di una cappa sterile o growbox.

Sterilizzazione dei semi/talee

Questa è sicuramente la fase più difficile.
Per sterilizzare semi e/o talee, utilizzeremo elementi chimici che dovranno agire quel tanto che basta per debellare germi e batteri senza rischiare però di distruggere i tessuti vitali con un tempo di trattamento eccessivamente lungo.
Dovendo trattare semi piccoli, la sterilizzazione può avvenire con il metodo della siringa.


Prendiamo una siringa sufficientemente grosso che permetta il passaggio dei semi che stiamo per trattare.
Prepariamo in un contenitore una soluzione di acqua (osmosi o distillata) e zucchero al 5%.
Inseriamo all'interno della siringa i semi ancora secchi e la soluzione zuccherina.
Premendo sullo stantuffo, facciamo uscire l'aria in modo che i semi siano completamente immersi nella soluzione.
Eventualmente per facilitare l'immersione dei semi inseriamo una goccia di sapone liquido.
Posizioniamo la siringa in un luogo caldo (vicino ad una fonte di calore) in modo che raggiunga una temperatura di circa 37° - 38° per circa 15 - 16 ore agitando ogni tanto.
La temperatura e la soluzione zuccherina, inizieranno ben presto a far germinare i batteri presenti sulla superficie dei semi.
Trascorso tale tempo, dobbiamo eliminare la soluzione zuccherina.
Per prima cosa togliamo l'ago, appoggiando il foro di uscita della siringa su di un foglio di carta assorbente o scottex ed agendo sullo stantuffo elimineremo tutto il liquido presente nella siringa facendo attenzione a non disperdere i semi.

Riempiamo la siringa di acqua ossigenata (Perossido di idrogeno al 3%) ed espelliamola come abbiamo fatto per la soluzione zuccherina ripetendo questa operazione 2 o 3 volte cercando di sciacquare il più possibile i semi.
Infine riempiamo nuovamente la siringa con acqua ossigenata (Perossido di idrogeno al 3%), espelliamo l'aria e lasciamo così i semi a mollo per circa 25 - 30 minuti in modo che la soluzione di acqua ossigenata debelli definitivamente germi e batteri.
Svuotiamo nuovamente la siringa con l'aiuto della carta assorbente lasciando all'interno della siringa i semi e circa 2mm di liquido.
I semi sono ora sterilizzati e pronti per essere immessi nei barattoli.
Se utilizziamo invece semi grossi e/o talee, la loro sterilizzazione deve necessariamente avvenire all'interno di una growbox o di una cappa sterile.
In questo caso la situazione si complica ulteriormente, perchè in questo caso dobbiamo lavorare in un ambiente il più possibile asettico come una cappa sterile o una growbox.
Inseriamo il vasetto chiuso, i semi e/o talee, attrezzi, soluzioni chimiche varie ed uno spruzzino con alcol a 70% nella growbox e chiudiamola ermeticamente.
Iniziamo a spruzzare all'interno della stessa l'alcol in modo da disinfettare l'ambiente.
Lasciamo riposare per circa 5 minuti.
Possiamo sterilizzare i semi e/o talee con una soluzione di acqua zuccherina e acqua ossigenata come visto per il metodo della siringa oppure utilizzare altre tecniche come la seguente.
Immergiamo le parti da trattare in alcol a 90° per circa 4 minuti.
Ripetiamo l'operazione con una soluzione di candeggina (ipoclorito di sodio) diluita in acqua al 3%, ed un paio di gocce di sapone liquido, lasciando a mollo i semi e/o talee per circa 25-30 minuti.
Trascorso tale tempo, sciacquare più volte le parti trattate con acqua di osmosi o distillata.
Semi e/o talee sono ora sterilizzati e pronti per essere inseriti nei vasetti.
Non aprite la growbox o la cappa sterile prima di aver inserito semi/talee nei vasetti ed aver ben chiuso questi ultimi.

Inserimento semi/talee nei vasetti

Nel caso in cui abbiamo utilizzato il metodo della siringa, dobbiamo solamente iniettare il liquido rimasto nella siringa con i semi, all'interno del vasetto, utilizzando il piccolo foro al centro del coperchio.


Non vi preoccupate della piccola quantità di acqua ossigenata poichè si dissolverà velocemente all'interno del vasetto.
Dopo aver inserito i semi nel vasetto, si dovrà chiudere il foro sul barattolo con del silicone.
Se invece abbiamo utilizzato l'altro metodo, con l'ausilio di pinzette (sterilizzate) inseriamo nel vasetto i semi/talee e chiudiamo perfettamente il contenitore.
A questo punto si può aprire tranquillamente la growbox o cappa sterile.

Controllo delle colture

Ecco il nostro vasetto pronto.

Da questo momento in poi, i vasetti non dovranno essere più aperti, collochiamoli in un ambiente relativamente caldo e sopratutto dove possono ricevere più luce possibile.

Se abbiamo agito correttamente, dopo breve tempo (questo dipende dal tipo di seme e/o talea) dovrebbero notarsi i primi risultati.
Ricordo ancora una volta che il successo della coltivazione in vitro dipende al 99% dal fatto di aver sterilizzato perfettamente contenitori e semi/talee e sopratutto di aver lavorato in un ambiente completamente asettico.
In caso contrario, muffe e funghi inizieranno ben presto a fare la loro comparsa come si vede nella foto sotto.